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Gewinnung und Charakterisierung antiviraler Wirkstoffe aus aquatischen Mikroorganismen
   
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Tanja König
Dipl. Ing. für Biotechnologie
Studium: Biotechnologie, TU Berlin
Tätigkeit: nicht mehr am Lehrstuhl; Promotion abgeschlossen


Im Rahmen dieser Arbeit wurden antivirale Wirkstoffe aus aquatischen Mikroorganismen identifiziert, die sich durch eine hohe Aktivität gegenüber dem humanen Cytomegalievirus (HCMV) auszeichnen. Aufgrund zunehmender viraler Resistenzen gegen herkömmliche Virustatika und unerwünschter Nebenwirkungen ist die Bereitstellung neuartiger Wirkstoffe von besonderer Relevanz. Bei den identifizierten Wirksubstanzen handelt es sich um anionische Exopolysaccharide (EPS) der einzelligen Rotalge Porphyridium purpureum sowie des Cyanobakteriums Arthrospira (Spirulina) platensis. Die EPS wurden jeweils durch eine Kombination von Filtration oder Dialyse sowie Chromatographie aus dem Kulturüberstand der Zellsuspensionen gewonnen. Die IC50-Werte (50 % virusinhibierende Konzentration) der EPS gegen HCMV betragen im verwendeten in vitro-Assay 100 µg ml-1 für P. purpureum sowie 4 µg ml-1 für A. platensis, wobei bis 5 mg ml-1 keine wesentlichen zytotoxischen Effekte im verwendeten Zellkultursystem beobachtet wurden (CC50 > 5 mg ml-1). Eine antivirale Wirksamkeit von EPS der Algengattung Porphyridium war bereits gegen Herpes- simplex-Virus-1 und -2 (HSV-1 und HSV-2) sowie Varicella-Zoster-Virus (VZV) beschrieben, jedoch nicht gegen die im Fokus dieser Arbeit stehenden β-Herpesviren. Die isolierten EPS aus P. purpureum sind neben HCMV auch gegen das humane Herpesvirus 6A (HHV-6A) und Vacciniavirus (VV) wirksam. Antivirale Polysaccharide aus A. platensis waren bisher nur als wässriges Isolat der Biomasse bekannt (Ca-Spirulan). Für die neuartigen Exopolysaccharide aus A. platensis wurden neben der Wirksamkeit gegen HCMV weitere Aktivitäten gegenüber HSV-1, HHV-6A, gegen das humane Immunodefizienzvirus-1 (HIV-1) sowie Vacciniavirus nachgewiesen. Aus der Stoffgruppe der Sulfolipide wurden chlorierte Alkylsulfate (CSL) aus Ochromonas danica mit einer antiviralen Aktivität gegen HCMV identifiziert. Im Gegensatz zu den EPS aus P. purpureum und A. platensis weisen die CSL eine vergleichsweise hohe Zytotoxizität gegen die humane Wirtszelllinie MRC-5 auf, so dass eine geringe antivirale Selektivität zu verzeichnen ist. Auch gegen verschiedene pro- und eukaryotische Organismen (Bakterien, Hefen, Pilz) konnte für die chlorierten Lipide aus O. danica eine wachstumsinhibierende Wirkung nachgewiesen werden. Ein entscheidendes Charakteristikum der EPS aus P. purpureum und A. platensis besteht im antiviralen Wirkmechanismus, der auf eine Inhibierung einer frühen Phase der Virusinfektion (Adsorption und/oder Fusion) hinweist. Die EPS unterscheiden sich somit von herkömmlichen Virustatika, die im Allgemeinen die virale DNA-Replikation blockieren. Um den Anforderungen an eine konstante Produktqualität nachzukommen und eine hohe Raum-Zeit-Ausbeute (RZA) zu erreichen, wurden Untersuchungen zur Produktivität und zum Einfluss von Kultivierungsarametern auf die Produktqualität am Beispiel der EPS aus P. purpureum durchgeführt. Aus den Untersuchungen ist zu schließen, dass die Oberflächenbestrahlungsstärke einen starken Einfluss auf die RZA besitzt, während die Produktqualität unter den gegebenen Versuchsbedingungen eine hohe Konstanz bezüglich der EPS-Zusammensetzung und der Bioaktivität aufweist. Im Rahmen einer Maßstabsvergrößerung konnte die EPS-Synthese von P. purpureum unter Erhalt der antiviralen Wirksamkeit aus dem 1 l- in den 25 l-Maßstab übertragen werden. Die Wirkstoffe wurden auf Basis ihrer Stoffeigenschaften mittels Filtration, Präzipitation und/ oder Chromatographie aufgereinigt. Im Anschluss erfolgte eine Wirkstoffcharakterisierung unter Verwendung physikalisch-chemischer Messmethoden. Diesbezüglich wurde eine weitgehende strukturelle Beschreibung der antiviralen EPS aus P. purpureum und A. platensis sowie der Chlorosulfolipide aus O. danica erzielt. Aufgrund des identifizierten Monomeraufbaus sowie der molaren Masse sind die EPS aus A. platensis strukturell vom intrazellulären Ca-Spirulan zu unterscheiden. Der Unterschied ist insbesondere im Fehlen von Uronsäuren im extrazellulären Produkt begründet. Bei den extrazellulären anionischen Polysacchariden aus A. platensis handelt es sich somit um neuartige Wirksubstanzen, deren in vitro Aktivität gegen HCMV sogar die des synthetischen Virustatikums Gancyclovir übertrifft.

Teile der vorliegenden Arbeit wurden unter anderem in Kooperation mit der Arbeitsgruppe von Prof. Siegert der Medizinischen Klinik II mit Schwerpunkt Onkologie und Hämatologie, Charité, Berlin, im Rahmen des AiF-Forschungsvorhabens 13883 BG sowie der Arbeitsgruppe von Prof. Marschall, Institut für Klinische und Molekulare Virologie, FAU Erlangen- Nürnberg durchgeführt.

Das AiF-Forschungsvorhaben 13883 BG wurde aus Haushaltsmitteln des Bundesministeriums für Wirtschaft und Arbeit (BMWA) über die Arbeitsgemeinschaft industrieller Forschungsvereinigungen "Otto von Guericke" e.V. (AiF) gefördert.

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Schwerpunkte:

  • Kultivierung von phototrophen Mikroorganismen in thermisch sterilisierbaren Photobioreaktoren ("Medusa")
  • Wirkstoffisolierung und Analytik: Extraktion, Fällung, Chromato-graphie, Spektrometrie
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Die Untersuchung der antiviralen Aktivität der mikrobiellen Zellextrakte gegen die humanen Herpesviren erfolgte in Zusammenarbeit mit der Arbeitsgruppe von Prof. Dr. Siegert an der HU Berlin, Charité.


 

   
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