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leer Bluedot   Produktion von Cyclotiden in pflanzlichen Zellkulturen von Oldenlandia affinis
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Peter Seydel
Dipl.-Ing. für Biotechnologie, Dr.-Ing.
Studium: Studium: Biotechnologie, TU Berlin
Tätigkeit: nicht mehr am Lehrstuhl
Promotion abgeschlossen


Im Rahmen dieser Arbeit wurde ein Verfahren zur Produktion von zyklischen Peptiden (Cyclotiden) mittels pflanzlicher Zellkulturen entwickelt. Cyclotide sind aufgrund ihrer hohen Stabilität und der bioaktiven Wirkungen mögliche Wirkstoffe der pharmazeutischen Industrie. Da ihre Bildung in in-vivo Pflanzen stark reguliert und die chemische Synthese momentan nicht wirtschaftlich ist, wird eine kontrollierte Produktion mit pflanzlichen Zellkulturen angestrebt. Für die Untersuchungen dient Oldenlandia affinis und das Kalata B1-Peptid als Modellsystem. Untersuchungen der Kalata B1-Konzentrationen in unterschiedlichen Teilen von Gewächshauspflanzen ergaben die höchsten in Blättern, die mit 1819 µg gTG-1 der Konzentration von Pflanzen in der natürlichen Umgebung entsprachen. Die aus Samen gezogenen in vitro Pflanzen akkumulierten bis zu 30 % der in vivo Pflanze. Nach Initiierung der in vitro Pflanzen von Oldenlandia affinis wurden unter Phytohormonvariationen verschiedene Zellkulturen auf Agar und in Suspension etabliert, wobei nur aus Blättern initiierte, beleuchtete und chlorophyllhaltige Kulturen eine nachweisbare Kalata B1-Produktion aufwiesen. In Kalluskulturen konnte mit steigender Bestrahlungsstärke bis 120 µmol m-2 s-1 eine steigende Konzentration und Produktivität von Kalata B1 sowie das optimale Wachstum im Bereich von 35 – 70 µmol m-2 s-1 festgestellt werden. Die Kalata B1-Akkumulation in den Suspensionskulturen wurde durch geringe Bestrahlungsstärken von 2 µmol m-2 s-1 angeregt und war nicht mit der Akkumulation von Chlorophyll assoziiert, stieg jedoch in stärker beleuchteten Kulturen, wie auch in Kalluskulturen beobachtet, an. Kalata B1-Konzentrationen in den Zellen lassen auf einen gemischt wachstumsbegleitenden/nicht-begleitenden Produktionsmodus schließen, mit höchsten Konzentrationen in der Verzögerungsphase von 370 µg gTG-1. Das Alter der Vorkulturen hatte bedeutenden Einfluss auf den Prozessverlauf. Suspensionskulturen mit 7 Tage alten Vorkulturen wiesen einen höheren Chlorophyllgehalt auf und zeigten beschleunigtes Wachstum im Gegensatz zu Kultivierungen mit 3 Tage alten Vorkulturen. In diesen war durch längere Saccharose-Verfügbarkeit als C- und Energie-Quelle die Chlorophyllsynthese gehemmt. Bei den untersuchten Zellkulturen zeigten morphologisch dedifferenzierte Suspensionskulturen die höchste Kalata B1-Produktivität von bis zu 460 µg l-1 d-1. Aufgrund ihrer guten Kultivierbarkeit waren sie, obwohl sie nur 16 % der Kalata B1-Konzentration von Hydrokulturen besitzen, für eine Kultivierung am besten geeignet. Ein erfolgreiches Scale-up wurde in einem 25-l-Reaktor durchgeführt mit Kalata B1-Produktivitäten von 95 µg Kalata B1 l-1 d-1, die 43 % der Konzentration in Erlenmeyerkolben entsprach. Die untersuchten Cyclotid-Spektren in O. affinis Suspensionskulturen beinhalteten zwölf bisher unbekannte Cyclotide, von denen Kalata N1 sequenziert und als Kalata B18, ein Bracelet-Cyclotid, besonders auffällig war, da diese Gruppe in der Pflanze nur wenige Vertreter besitzt. Die geringere Konzentration von Kalata B1, die in Zellkulturen im Gegensatz zu in vitro Pflanzen erreicht werden konnte, ist unter Umständen auf fehlende Speicherorte in Zellkulturen und eine mögliche Endprodukthemmung zurückzuführen. Dies wurde auch durch die Elicitierungsversuche zur Aktivierung des Stressmetabolismus und Kalata B1 als Verteidigungspeptid untermauert. So wurde in feinen Suspensionskulturen in der Wachstumsphase durch Chitosan-Zugabe eine Steigerung der Kalata B1 Konzentration auf das Doppelte, in der stationären Phase jedoch keine weitere Zunahme erreicht. In Hydrokulturen hingegen stieg die Konzentration durch Elicitierung um 28 % auf 3115 µg gTG-1 an. Die Steigerung der Kalata B1 Konzentrationen in den Zellen durch Elicitierung ist ein weiteres Indiz für die vermutete Aktivität der Cyclotide als Verteidigungsmetabolite. In einem etablierten Inhibierungsassay zeigten Kalata B1, B1var, B2 und B7 bis zu einer Konzentration von 50 µg ml-1 keine hemmende Wirkung auf Oldenlandia affinis Suspensionskulturen, während Kalata B1 bei 50 µg ml-1 die Reduktase-Aktivität einer nicht Cyclotide produzierenden Nicotiana tabacum Kulturen bereits um 50 % hemmte, was auf eine Resistenz von O. affinis schließen lässt. Teile der vorliegenden Arbeit wurden in Kooperation mit der Arbeitsgruppe von Prof Bohlin, Department of Medicinal Chemistry, Uppsala University, Schweden sowie der Arbeitsgruppe von Prof. Craik, Institute of Molecular Bioscience, University of Queensland, Australien, durchgeführt.

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