Logo Universität
HOME
ÜBER UNS
MITARBEITER
FORSCHUNG
LEHRE
VORLESUNGEN
DIPLOMARBEITEN
Platz
ALLGEMEINES
KOOPERATIONEN
DOWNLOADS
Linie
Linie
Lehrstuhl für Bioverfahrenstechnik
leer leer
Promotionen
 
leer Bluedot   Polyelektrolyt-basierter UV-Schutz für Biopestizide
    Linie
leer  


Ozan Orakci
Dipl. Ing. für Biotechnologie
Studium: Biotechnologie, TU Berlin
Tätigkeit: nicht mehr am Lehrstuhl


Baculoviren sind natürlich vorkommende Pathogene vieler in der Landwirtschaft als Schädlinge auftretender Insektenarten. So wird z.B. das Cydia pomonella Granulose Baculovirus (CpGV) gegen den Apfelwickler eingesetzt. Der Vorteil der Baculoviren ist, dass sie sehr spezifisch wirken und rückstandsfrei abgebaut werden, so dass sie aufgrund ihrer Unbedenklichkeit für Mensch und Umwelt und einer strenger werdenden Umweltgesetzgebung eine Alternative zu chemisch-synthetischen Mitteln darstellen. Ihr wesentlicher Nachteil ist ihre schnelle Inaktivierung bei ihrer Anwendung auf dem Feld durch die ultraviolette Strahlung der Sonne. In der Arbeit wurden Untersuchungen zur Erhöhung der UV-Lichtbeständigkeit von CpGV mittels Polyelektrolytbeschichtungen durchgeführt, um sie wirtschaftlicher und effizienter einsetzen zu können. Das untersuchte Verfahren beruht auf dem neuartigen Ansatz, die nur Nanometer großen Viruseinschlusskörper, wie die Virusdauerformen der Baculoviren genannt werden, durch schichtweises Auftragen von Polyelektrolyten (PEL) mit UV-absorbierenden Eigenschaften als einzelne Partikel zu umhüllen. Dieses Verfahren basiert auf einer Reaktion der Polyelektrolyte (PEL), die als Simplexmembran- bzw. Koacervatbildung bekannt ist. In der Arbeit wurde eine Beschichtungsprozedur mittels optimierter Polymerpaare sowie Polymerund Viruseinschlusskörperkonzentrationen entwickelt. Als Polyelektrolyte mit UV-absorbierenden Eigenschaften kamen anionische Ligninverbindungen und Varianten dieser Ligninverbindungen zum Einsatz, die mit Hilfe einer chemischen Kationisierungsreaktion hergestellt wurden. Im Laborversuch wurde eine maximale Erhöhung der natürlichen UV-Beständigkeit durch die Beschichtung in Form einer Steigerung der Halbwertsdosis des Saccharosegradienten-gereinigten CpGV um Faktor 6,4 und der des leicht vorgereinigten CpGV (Rohvirusmaterials) um Faktor 2,6 für eine 2fach-Beschichtung mit einem kationisierten Lignin erreicht (Ligninsorte: kationisiertes und unbehandeltes Marasperse 03M-31). Ferner zeigte sich, dass die Kationisierung der Lignine zu einer zusätzlichen spezifischen Aktivitätssteigerung der CpGV im in vivo Biotest führt, welche in der Größenordnung bis Faktor 3 liegt (Synergie-Effekt). Es wurde ebenfalls beobachtet, dass insbesondere bei Auftragung von Mehrfach-Schichten zu es Aktivitätsverlusten kommt, welche auf eine vermutete Quervernetzung bzw. Verklumpung der Viruseinschlusskörper durch die Polyelektrolyten (PEL) zurückzuführen ist. Ein Freilandversuch mit beschichteten CpGV und theoretische Überlegungen dazu zeigten, dass aufgrund der geringen natürlichen UV-Lichtbeständigkeit der Baculoviren und der hohen eingestrahlten Tagesdosis auf dem Feld, höhere Steigerungen der UV-Beständigkeit bzw. der Halbwertsdosis als die in dieser Arbeit erreichten notwendig sind, um vorteilhafte Effekte in der praktischen Anwendung auf dem Feld zu bewirken. Im weiteren Teil dieser Arbeit wurden Untersuchungen für ein in vitro Testsystem zur Aktivitätsbestimmung von Insektenviren durchgeführt, um verschiedene UV-Schutzbeschichtungen auf ihre Eignung hin testen zu können. Im Gegensatz zum herkömmlichen in vivo Biotest mit lebenden Larven, für die eigens eine Raupenzucht benötigt wird, kann dieser Test mit der Ausstattung eines Zellkulturlabors durchgeführt werden. Als Modellsystem für die Bestrahlungsversuche wurden Viruseinschlusskörper des Autographa californica MNPV (AcMNPV) verwendet, welche durch gleichzeitige Infektionen (Co-Infektion) der Zellen der etablierten und weitverbreiteten Insektenzelllinie Spodoptera frugiperda (Sf21) mit dem Wildtyp-AcMNPV und einem rekombinanten AcOGFP-Virus gewonnen wurden. Dazu wurden für die Co-Infektion durch Variation der zahlenmäßigen Verhältnisse von Wildtyp- AcMNPV und AcOGFP-Virus pro Zelle (=MOI) die geeigneten Bedingungen zur Produktion der Co- Infektions-Einschlusskörper ermittelt. Die Quantifizierung der Virusaktivität erfolgte mittels Titerbestimmung nach der TCID50-Methode in Mikrotiterplatten (96-Lochplatten), nachdem die Virionen durch eine zuvor entwickelte Prozedur aus den Viruseinschlusskörpern alkalisch freigesetzt wurden. Durch den Einsatz des rekombinanten AcOGFP-Virus, welches anstelle des Polyhedrin-Gens das Gen für das "Green Fluorescent Protein (GFP)" trägt, konnte die Detektion von Infektionen vereinfacht werden. Bei der Infektion einer Insektenzelle mit einem AcOGFP-Virus wird die Expression des GFP in der Zelle induziert, so dass unter dem Fluoreszenzmikroskop bei entsprechender Anregung eine charakteristisch grünfluoreszierende Färbung der Zelle beobachtet werden kann. Da der TCID50-Test in Zellkultur steril erfolgen muss, wurden Versuche zur Sterilfiltration der alkalisch freigesetzten Virionen durchgeführt, die zeigten, dass die Virionen größtenteils vom Filtermaterial abgehalten werden. Dies bedeutet, dass für den in vitro Test durchgehend steril gearbeitet werden muss, da eine nachträgliche Sterilisation nicht möglich ist. Bei den im Abschluss durchgeführten Bestrahlungsreihen konnte das Auftreten einer Schwellenstrahlendosis im in vitro Test beobachtet werden, ab der erst eine merkliche Inaktivierung der Viren in den Einschlusskörpern stattfindet. Bei weiterer Bestrahlung konnte in Anhängigkeit von der Strahlendosis ein exponentieller Abfall der viralen Aktivität beobachtet werden, der dem des herkömmlichen in vivo Tests entspricht.

leer  


Schwerpunkte:

  • Auswahl geeigneter Beschichtungssubstanzen mit UV-Licht absorbierenden Eigenschaften
  • Entwicklung und Optimierung des Beschichtungsverfahrens

leer  
Das Projekt war eine Kooperation zwischen der Friedrich-Alexander Universität und der PROBIS GmbH (Gesellschaft zur Produktion biologischer Schädlingsbekämpfungsmittel) in Wiernsheim. Bei unserem Projektpartner wurden die Biotests mit den oberflächenbehandelten Insektenviren durchgeführt.


 

    top