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leer Bluedot   Sulfoquinovosyldiacylglyceride - antiviral aktive Substanzen
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Ivonne Naumann
Dipl. Ing. für Biotechnologie
Studium: Biotechnologie, TU Berlin
Tätigkeit: nicht mehr am Lehrstuhl; Promotion abgeschlossen


Die Substanzklasse der Sulfoquinovosyldiacylglyceride (SQDG) stellt eine Gruppe potentiell antiviraler Wirkstoffe aus phototrophen Mikroorganismen dar, an dessen Beispiel in der vorliegenden Arbeit eine erfolgreiche Strategie der Entwicklung von entsprechenden Wirkstoffkandidaten aufgezeigt wird. Ausgehend von Literaturdaten sind potentielle SQDG-bildende Stämme aus den Algenabteilungen Rhodophyta (Porphyridium purpureum), Heterokontophyta (Heterosigma carterae, verschiedene Spezies Phaeodactylum tricorntum), Chlorophyta (Chlorella kessleri, Chlorella salina, Chlorella vulgaris) und Cyanophyta (verschiedene Spezies Arthrospira platensis, Scytonema hofmanni, Nostoc punctiforme) selektiert und zur Biomassegewinnung in 1 l Photobioreaktor-Screening-Modulen kultiviert worden. P. purpureum kann in den Untersuchungen bereits frühzeitig als SQDG-Produzent identifiziert werden. Die Biomasse der Alge bzw. der daraus gewonnene Extrakt wird daher zur Etablierung der Trennverfahren für die Gewinnung von SQDG und deren Strukturcharakterisierung mit matrix assisted laser desorption ionization (MALDI) trap time of flight (ToF) Hybrid MSn Massenspektrometrie eingesetzt. Als Aufreinigungsmethoden der SQDG eignen sich die Dünnschichtchromatographie (DC), als auch ein Adsorptions/ Desorptions-Trennverfahren mit aminopropylmodifiziertem Kieselgel. Im Rahmen von MALDI-MSn-Experimenten können die vorkommenden SQDG von P. purpureum in ihrer Struktur identifiziert werden. Die SQDG-Molekülionen werden im MS1 und die am Glycerol veresterten Acylreste C16:0, C18:2, C20:4 und C20:5 im MS2 bestimmt. Ein zusätzlicher enzymatischer Verdau der SQDG mit der regioselektiven Lipase aus Rhizopus arrhizus resultiert in der Hydrolyse der sn-1-veresterten ungesättigten Fettsäuren. Ableitend daraus kann die massenspektrometrische Eliminierung der ungesättigten Fettsäuren an dieser Position (MS2) geklärt werden. Die Sulfoquinovose als charakteristisches Strukturelement wird im MS3-Experiment bestätigt. Die MALDI-Untersuchungen identifizieren zudem SQDG in den Mikroalgen H. carterae und den Spezies von P. tricorntum sowie den Cyanobakterien S. hofmanii, N. punctiforme und einem Spezies von A. platensis. Die SQDG aus den Mikroalgen variieren in der sn-1-veresterten ungesättigten Fettsäure. An sn-2-Position der SQDG ist in den Mikroalgen ein Palmitoylrest lokalisiert, der einen prokaryotischen Biosyntheseweg der SQDG in eukaryotischen Mikroorganismen kennzeichnet. Die SQDG-produzierenden Cyanobakterien A. platensis und N. punctiforme können SQDG sowohl prokaryotisch als auch eukaryotisch (C18-Fettsäure an sn-2-Position) synthetisieren. Zusätzlich zu den SQDG kann in den selektierten P. tricornutum-Stämmen die Bildung von acylierten Sulfoquinovosyldiacylglyceriden (Ac-SQDG) mit der MALDI ToF Analytik nachgewiesen werden. Die Ac-SQDG besitzen im Gegensatz zu den SQDG an der 2´-Position der Sulfoquinovose eine zusätzlich veresterte Fettsäure. Zur Untersuchung der antiviralen Aktivität der SQDG ist aufgrund der sehr hohen klinischen Relevanz das humane Cytomegalievirus (HCMV) als Targetvirus ausgewählt und eine Immunoperoxidasefärbung (POX) im zellkulturbasierten Assay mit MRC-5-Fibroblasten etabliert worden. Dabei wird die Viruslast über die Detektion der viralen Immediate Early (IE) Proteine ermittelt. IE-Proteine werden direkt nach dem Eindringen des Virus in die Wirtszelle gebildet. Eine Reduktion der detektierten viralen IE-Proteine in den MRC-5-Zellen lässt damit auf eine Inhibierung der Virusreplikation zu einem frühen Zeitpunkt (Adsorption, Fusion) schließen. Für die Reduktion der HCMV-Replikation um 50 % (IC50) kann nach Inkubationen von isolierten SQDG aus verschiedenen phototrophen Mikroorganismen mittels IE-POX-Assay ein Konzentrationsbereich von 33 bis 93 µg ml-1 bestimmt werden. Die SQDG-Fraktion von S. hofmanii (SQDG C18:2/C16:0) zeigt mit einer ermittelten IC50 von 19 µg ml-1eine höhere antivirale Aktivität. Dieser Wert unterscheidet sich damit im Vergleich zur Referenzsubstanz Dextransulfat (IC50 1,6 µg ml-1) um eine Größenordnung. Die Inhibierung der HCMV-Viruslast kann zudem für die isolierten Ac-SQDG-Fraktionen nachgewiesen werden. Untersuchungen zur Optimierung der SQDG-Produktion sind am Beispiel von A. platensis unter Variation der Prozessparameter Bestrahlungsstärke (30, 60, 80, 110, 140 µE m-2 s-1) und Phosphatquelle im Medium durchgeführt worden. Die maximale Raum-Zeit-Ausbeute (RZA) von 0,16 mgSQDG l-1 d-1 resultiert bei einer Kultivierung mit 110 µE m-2 s-1. Durch Sublimation von K2HPO4 durch K2P2O7 im Medium bei entsprechenden Kultivierungsbedingungen kann die RZA um 20 % gesteigert werden.

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Schwerpunkte: 

  • Kultivierung von phototrophen Mikroorganismen in thermisch sterilisierbaren Photobioreaktoren ("Medusa")
  • Wirkstoffisolierung und Analytik: Extraktion, Fällung, Chromatographie, Spektrometrie
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Die Untersuchung der antiviralen Aktivität der mikrobiellen Zellextrakte gegen die humanen Herpesviren erfolgte in Zusammenarbeit mit der Arbeitsgruppe von Prof. Dr. Siegert an der HU Berlin, Charité.


 

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